Mlečnokislinska fermentacija

Tokrat objavljam nekoliko daljši in mogoče malenkost zahtevnejši članek o mlečnokislinski fermentaciji. Gre za kompleksen proces v katerem sodelujejo številni mikroorganizmi, ki pretvarjajo številne snovi. Skušal sem se omejiti le na najpomembnejše stvari, mestoma pa so opisani tudi nekateri bolj zapleteni procesi, ki naj prispevajo k boljšemu razumevanju pojava mlečnokislinske fermentacije.

Mlečnokislinska fermentacija je pretvorba jabolčne kisline v mlečno. Ne gre za pravo fermentacijo, pač pa za encimatsko pretvorbo, ki poteka v celicah mlečnokislinskih bakterij. Navadno sledi alkoholni fermentaciji, a lahko poteka tudi hkrati z njo. Vodijo jo predvsem bakterije Oenococcus oeni. Ta vrsta je odporna na pH-je nižje od 3,5 (kakršni se pogosto pojavljajo v mladem vinu severnih pridelovalnih območij), alkoholne stopnje višje od 10 % in vsebnost prostega SO₂ do 50 mg/l. Poleg O. oeni se v vinu pojavljajo še drugi rodovi, recimo Lactobacillus, Leuconostoc in Pediococcus, še posebej kadar je pH vina višji od 3,5.

Mlečnokislinske bakterije prispevajo k znižanju kislosti vin v severnih pridelovalnih območjih, prispevajo k okusu in kompleksnosti vinske arome ter izboljšujejo mikrobiološko stabilnost vina.

Nekontrolirana mlečnokislinska fermentacija lahko privede do raznih napak in bolezni vina, na primer povišanih hlapnih kislin, hlapnih fenolov, miševine ter produkcije toksičnih snovi, kot so biogeni amini in etil karbamat.

MLEČNOKISLINSKE BAKTERIJE

MK bakterije so naravno prisotne na kožicah grozdnih jagod. Pojavljajo se tudi v sodih, cisternah in ostali opremi, ki jo uporabljamo v procesu vinifikacije.

MK bakterije v vinu pripadajo dvema družinama:

–  Lactobacillaceae -> rod Lactobacillus
–  Streptococcaceae -> rodova Oenococcus in Pediococcus

Po načinu metabolizma sladkorjev, jih delimo med homofermenterje, ki pretvarjajo glukozo v mlečno kislino in heterofermenterje, ki glukozo pretvorijo v mlečno kislino, 2,3-butandiol, etanol, ocetno kislino in CO₂.

KRATEK OPIS POSAMEZNIH RODOV MLEČNOKISLINSKIH BAKTERIJ

LACTOBACILLUS

So mikroaerofili, rastejo v okoljih z nizkimi koncentracijami kisika, sicer so fakultativni anaerobi (lahko živijo in se razmnožujejo brez prisotnosti kisika). Za razvoj potrebujejo okolje bogato s hranili, ki vsebuje presnovljive sladkorje. Glede na metabolizem sladkorjev se delijo na striktne heterofermenterje (L. brevis, L.hilgardii) in fakultativne heterofermenterje (L. casei, L. plantarum).

PEDIOCOCCUS

So fakultativni anaerobi. Potrebujejo bogat medij s presnovljivim sladkorjem. Optimalna temperatura za rast je 25 – 30°C. Dobro uspevajo pri visokem pH 6. So homofermenterji.

OENOCOCCUS (Oenococcus oeni – po stari sistematiki Leuconostoc oeni)

So fakultativni acidofilni anaerobi. Razvijajo se pri pH 4,8. Idealna temperatura za rast je med 18 – 30°C. Potrebujejo s hranili bogat medij. Alkoholne stopnje nad 10 % ne onemogočajo njihovega razvoja. So heterofermenterji, poleg tega pa so edini rod mlečnokislinskih bakterij, ki pretvarja jabolčno kislino v mlečno kislino in CO₂, ob prisotnosti presnovljivega sladkorja.

RAZVOJ MLEČNOKISLINSKIH BAKTERIJ MED VINIFIKACIJO

Med trgatvijo kvasovke in bakterije naselijo vinsko klet. MK bakterije so na jagodnih kožicah in v moštu zastopane v zelo majhnem številu. Pojavljajo se predvsem vrste L. plantarum, L.casei, L. mesenteroides in O. oeni. V prvih dneh fermentacije se pričnejo razmnoževati, a njihovo število ostaja majhno, okoli 10^4 celic/mL. V nadaljevanju fermentacije to število še upade na 10^2 celic/mL, zaradi občutljivosti na alkohol in nizek pH. Po tej fazi se začnejo intenzivno razmnoževati, njihovo število doseže 10^6 do 10^8 celic/mL. V tej fazi poteka mlečnokislinska fermentacija, ki se konča, ko bakterije dosežejo stacionarno fazo (se prenehajo razmnoževati).

Glavne bakterije v procesu mlečnokislinske fermentacije so O. oeni. Njihov razvoj je naraven, vendar ga lahko pospešimo z dvigom temperature na 20 – 25°C ob nizki vsebnosti SO₂ (manj kot 15 – 20 mg/hl prostega SO₂). Po končani mlečnokislinski fermentaciji začnejo delovati bakterije iz rodov Lactobacillus in Pediococcus.

DEJAVNIKI MLEČNOKISLINSKE FERMENTACIJE

Omejujoči dejavniki mlečnokislinske fermentacije so v prvi vrsti pomanjkanje hranil, ki je v vinu pogosto, poleg tega na razmnoževanje bakterij vplivajo še:

– temperatura – visoke, nizke temperature otežujejo MK fermentacijo
– pH – nizek pH pod 3,0 oz. 3,2 ob prisotnosti alkohola preprečuje razvoj MK bakterij
– visoki alkoholi in visoke stopnje prostega SO₂ lahko ubijejo bakterije

Do zastoja oz. upočasnjene MK fermentacije lahko pride zaradi:

– neugodnih pogojev v vinu
– težav pri razmnoževanju MK bakterij, ki ne dosežejo dovolj velike populacije za nemoteno mlečnokislinsko fermentacijo

V nekaterih primerih je potrebno več tednov, ali celo mesecev, da populacija bakterij doseže zadostno število celic za razgradnjo jabolčne kisline v rdečih vinih. Zato se danes vse pogosteje uporabljajo selekcionirane kulture mlečnokislinskih bakterij.

POMEMBNI METABOLNI PROCESI PRI MLEČNOKISLINSKI FERMENTACIJI

Najpomembnejši in zaželen proces MK fermentacije je pretvorba jabolčne kisline v mlečno kislino in CO₂. Vendar ta proces ne zagotovi vseh potrebnih snovi in energije, ki jih MK bakterije potrebujejo za razmnoževanje. Zato te potrebe pokrijejo s pomočjo številnih drugih metabolnih poti, v katerih konzumirajo sladkorje, vinsko kislino, glicerol, nekatere aminokisline, itd.

METABOLIZEM OGLJIKOVIH HIDRATOV (SLADKORJEV)

Sladkorji so glavni vir energije za rast bakterij. Najpogosteje MK bakterije konzumirajo glukozo in trehalozo. Metabolizem sladkorjev je odvisen od vrste bakterij, zato nekateri heterofermenterji znatno prispevajo k zvišanju hlapnih kislin v vinu (tvorba ocetne kisline). V do konca povretem vinu ostanejo le nefermentirani sladkorji, ki zagotavljajo potrebno energijo za razmnoževanje MK bakterij.

METABOLIZEM ORGANSKIH KISLIN

PRETVORBA JABOLČNE KISLINE

Je glavna reakcija mlečnokislinske fermentacije. Kemijsko gre za dekarboksilacijo L-jabolčne kisline v L-mlečno kislino, pod vplivom malolaktičnega encima. V procesu se znižajo skupne kisline vina, poviša se pH. Vino postane po okusu mehkejše, prijetnejše, saj je jabolčna kislina kisla in trpka. Trajanje tega procesa je odvisno od razpoložljive količine jabolčne kisline in velikosti populacije bakterij.

PRETVORBA CITRONSKE KISLINE

Vinska in jabolčna kislina sta v skupni kislosti vina zastopani v največji količini (nekaj gramov/l), citronske kisline je bistveno manj, le 200 – 300 mg/l. MK bakterije jo pretvarjajo v ocetno kislino in diacetil ter nekatere druge acetonske snovi, katere vplivajo na aromo vina. Diacetil v nizkih koncentracijah (do 5 mg/l) prispeva h kompeksnosti arome vina (vonj po karameli, orehih), v koncentraciji nad 5 mg/l pa postane neprijeten, vino dobi vonj po maslu. Tvorba diacetila je odvisna od bakterijskega seva, pH, kontakta s kvasnimi ovojnicami in vsebnosti SO₂. Vino redko prizadene do te mere, da bi postalo neužitno.

METABOLIZEM FENOLOV

Raziskovalci največ pozornosti namenjajo pretvorbi freulične in kumarne kisline v hlapne fenole (4-etilguaiakol in 4-etilfenol), ki povzročajo napake in bolezni vina, če se pojavijo v vinu v določeni količini. Povzročajo naslednje organoleptične zaznave:

–  4-etilguaiakol v koncentraciji nad 600 mg/L: vonj po slanini, začimbah, dimu
–  4-etilfenol v konc. nad 140 mg/L: vonj po hlevu, zdravilih, miševina

Obe snovi lahko proizvajajo tudi kvasovke vrste Brettanomyces.

METABOLIZEM AMINOKISLIN

Žveplo vsebujoče AK (cistein, metionin) se pretvarjajo v H₂S (bekser), metantiol, dimetil disulfid, 3-(metildisulfidfanil) propan-1-ol, 3-(metildisulfanil) propionska kislina. Te snovi v večji meri tvorijo bakterije vrste O. oeni, manj bakterije iz rodu Lactobacillus. Povzročajo vonje po gnilobi, fekalijah, kuhanem zelju…

VPLIV MLEČNOKISLINSKE FERMENTACIJE NA ORGANOLEPTIČNE LASTNOSTI VINA

MK fermentacija naj bi v vinu povečevala sadne in maslene arome in zmanjševala vonj po zelenjavi in zelenju. Poleg teh se pojavljajo še številne druge arome, po cvetju, vaniliji, lesu, medu… Tvorba posamezne arome je odvisna od vrste oziroma seva bakterij. MK fermentacija povzroči razpad nekaterih barvil (antocianov), kar se kaže v zmanjšanju intenzivnosti modre barve. Tvorijo se tudi polisaharidi, ki vinu dajejo širino in telo. Če polimerizirajo s tanini iz grozdnih jagod ali lesa, se zmanjša grobost in trpkost vina, posledično nastanejo bolj kompleksni okusi.

UPORABA SELEKCIONIRANIH BAKTERIJSKIH KULTUR (STARTER KULTURE)

Uporaba selekcioniranih bakterijskih sevov, katere dodamo vinu, v katerem želimo sprožiti mlečnokislinsko fermentacijo prinaša nekatere prednosti pred spontano MK fermentacijo. Pridobimo boljši nadzor nad začetkom in potekom MK fermentacije, poleg tega imamo nadzor nad sevom bakterij, ki vodijo proces. Navadno gre za mešanice 2 – 3 sevov bakterij O. oeni. Ti preprečujejo razvoj rodov Lactobacillus in Pediococcus, kateri lahko tvorijo velike količine ocetne kisline in biogene amine.

Starter kulture na tržišču najpogosteje najdemo kot liofilizirane pripravke, pri rehidraciji katerih moramo biti previdni, da povrnemo bakterijskim celicam vitalnost, potrebno za preživetje v vinu. Vnašamo jih najpogosteje ob koncu alkoholne fermentacije.

Selekcionirane kulture mlečnokislinskih bakterij lahko kupite v podjetju Enomarket Kojsko d.o.o.

NAPAKE IN BOLEZNI ZARADI DELOVANJA MLEČNOKISLINSKIH BAKTERIJ

Več vrst MK bakterij lahko povzroči resne napake in bolezni vina, saj so zmožne razgradnje snovi, ki povzročijo v vinu nezaželene organoleptične zaznave, recimo povišane hlapne kisline (ocetni cik), manitni cik, grenkobo (akroleinski cik), miševino, degradacijo vinske kisline, povečano produkcijo diacetila, maslenokislinski cik, vlečljivost vina, itd. Te zaznave povzročajo nekatere vrste Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus in Pediococcus.

Ko se upočasni ali zaustavi alkoholna fermentacija, nastanejo ugodni pogoji za razvoj teh bakterij. Prihaja do:

–  pretvorbe sladkorjev v ocetno kislino in D-mlečno kislino – mlečnokislinski cik
–  razpada glicerola na akrolein, ki se veže na fenole – grenkoba
–  encimske pretvorbe fruktoze v manitol – manitni cik
–  razgradnje vinske kisline v ocetno, mlečno in sukcinsko kislino
–  tvorbe hlapnih fenolov – vonji po živali, hlevu, urinu…
–  produkcije dekstranov ali glukanov – vlečljivost vina
–  pretvorbe ornitina in lizina v 2-acetil-1-pirolen, 2-acetiltetrahidropiridin in 2-etiltetrahidropiridin – miševina. Te snovi niso hlapne pri nizkih pH-jih vina, vendar postanejo v ustih, kjer je pH nevtralen in povzročijo vonj/okus po mišjem urinu. Miševino povzročajo tudi kvasovke rodu Brettanomyces.

TOKSIKOLOŠKI PROBLEMI V VINU

V metabolizmu aminokislin lahko prihaja do tvorbe biogenih aminov in prekurzorjev etil karbamata v vinu, snovi ki so za človeka toksične.

– biogeni amini – so naravno prisotni v hrani in pijači (histamin, tiramin, putrescin) in ob zaužitju vplivajo na živčni in vaskularni sistem
–  etil karbamat – heterofermenterji lahko razgradijo arginin na citrulin, ki je prekurzor etil karbamata. Do pretvorb prihaja v vinih z visoko vsebnostjo aminokisline arginin. To lahko preprečimo z uporabo selekcioniranih sevov O. oeni.

Natančneje o napakah in boleznih vina, ki lahko nastanejo kot posledica delovanja mlečnokislinskih bakterij pa v enem od prihodnjih člankov.

VIRI

MORENO-ARRIBAS M. Victoria, POLO Carmen; Wine Chemistry and Biochemistry; Springer Science, 2009; p. 27 – 57;
ŠIKOVEC Slavica, Vinarstvo – od grozdja do vina; Kmečki glas; 1993